CCK-8試劑盒在的實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。
如雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和生物素的ELISA。CCK-8試劑盒TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。
CCK-8試劑盒的詳細(xì)操作規(guī)程：
1、使用前請(qǐng)先將試劑盒在室溫下平衡半小時(shí)。
2、空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調(diào)零。
3、標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，零孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必須要做，并將其作為標(biāo)曲的后一個(gè)點(diǎn))。
4、樣品孔：加入樣品50μl（推薦直接加樣，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。
5、輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。
6、將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。
7、次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
8、加入50μl親和素-HRP到標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。
9、第二次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
10、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
11、終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
12、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
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