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氯霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：  0.02ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～15min

1. 樣本檢測限

組織、蜂蜜、牛奶···································· 0.1ppb 奶粉、蛋類、尿樣、飼料··························· 0.15ppb

1. 交叉反應(yīng)率

氯霉素 ·············································· 100%

甲砜霉素 ········································· < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

1. 樣本回收率

組織、蛋類、奶粉····························· 85%±20% 蜂蜜、牛奶、飼料····························· 93%±25%

尿樣··········································  100%±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

試 劑：乙酸乙酯、正己烷

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

1. 樣本前處理需配制：配液 1 樣本復(fù)溶液：

• 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

1. 樣本處理：

（a）肌肉組織樣本處理方法

1、稱取均質(zhì)后的新鮮樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中，加入 3ml 去離子水后再加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；

2、取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干；

3、加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml 樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  0.5 倍

此方法無法檢測肝臟類樣本，處理時易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，影響檢測結(jié)果(乳化時建議處理方法：去除上層有機相再加入 2ml 正己烷混合 30s，室溫 4000r/min

以上離心 10min；去除上層有機相)。（b）蜂蜜處理方法

1、稱取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 2ml 去離子水溶解；加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；

2、移取 3ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合 30s；

3、取 50 µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)： 0.5 倍

（c）牛奶、奶粉、蛋類樣本處理方法

1、稱取均質(zhì)后的新鮮樣本 2±0.05g（或 2ml）于 50ml 離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，

室溫 4000r/min 以上離心 10min；2、取出 3ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干；

3、加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml 樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

處理時如無法取到 3ml 上層液體，可以重復(fù)離心后再取液，或加入 10ml 乙酸乙酯后取 5ml 吹干，稀釋倍數(shù)不變。

（d）尿樣、飼料樣本處理方法

1、稱取均質(zhì)后的新鮮樣本 1±0.05g（或 1ml）于 50ml 離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯，振蕩 1min，

室溫 4000r/min 以上離心 10min；2、取出 3ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干；

3、加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml 樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心10min；去除上層有機相；

4、取 50 µl 下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2 倍

六、酶標免疫分析程序:

1. 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～

25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放

入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶標記物 50µl/孔，后加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境

中反應(yīng) 30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。

8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含氯霉素量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：

 0ppb 為 2.143；0.02ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415； 0.18ppb 為 0.74；0.54ppb 為 0.313；1.62ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 0.54ppb～1.62ppb；樣本 2

 的濃度范圍是 0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應(yīng)

稀釋倍數(shù) 即為樣本中氯霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。 

八、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。

2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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